Illumina sequencing

Illumina sequencing adalah salah satu teknologi pengurutan DNA generasi berikutnya (next-generation sequencing/NGS) yang dikembangkan oleh perusahaan Illumina, Inc. Teknologi ini telah menjadi metode dominan dalam penelitian genomik modern karena kemampuannya menghasilkan data dalam jumlah besar dengan biaya yang relatif rendah dan tingkat akurasi yang tinggi. Illumina sequencing digunakan secara luas dalam berbagai bidang, termasuk penelitian medis, diagnostik molekuler, studi evolusi, hingga metagenomik lingkungan. Prinsip dasarnya melibatkan pengikatan fragmen DNA ke permukaan padat, amplifikasi klonal, dan pembacaan urutan nukleotida melalui metode sequencing by synthesis.

Illumina Sequencing

Sejarah dan Pengembangan

Teknologi Illumina sequencing berawal dari akuisisi perusahaan Solexa oleh Illumina pada tahun 2007. Solexa mengembangkan metode sequencing by synthesis yang menjadi inti teknologi ini. Setelah akuisisi tersebut, Illumina terus memperbaiki platformnya, meningkatkan kapasitas throughput, memperkecil biaya per basa, dan memperpanjang panjang baca (read length). Dalam waktu singkat, Illumina menggeser dominasi metode Sanger sequencing di banyak laboratorium penelitian karena keunggulan efisiensi dan skala produksinya.

Prinsip Kerja

Prinsip kerja Illumina sequencing melibatkan tahapan kunci yang memungkinkan pembacaan urutan nukleotida secara paralel dalam jumlah besar. Fragmen DNA yang akan diurutkan terlebih dahulu diadaptasi dengan penambahan adaptor khusus. Fragmen ini kemudian diikatkan ke permukaan flow cell yang dilapisi dengan oligonukleotida komplementer. Proses amplifikasi PCR klonal dilakukan secara lokal pada flow cell sehingga terbentuk cluster DNA identik yang memudahkan deteksi sinyal fluoresensi.

Tahapan Proses

Secara umum, Illumina sequencing dilakukan melalui tahapan berikut:

1. Persiapan perpustakaan DNA (library preparation) termasuk fragmentasi DNA dan ligasi adaptor.
2. Loading sampel ke dalam flow cell.
3. Amplifikasi klonal melalui bridge amplification.
4. Sequencing by synthesis menggunakan nukleotida berlabel fluoresen.
5. Pencitraan (imaging) untuk mendeteksi sinyal dari setiap siklus penambahan basa.
6. Analisis data untuk menghasilkan urutan akhir.

Sequencing by Synthesis

Metode sequencing by synthesis pada Illumina menggunakan nukleotida yang diberi label fluoresen dan dimodifikasi secara reversible terminator. Pada setiap siklus, satu jenis nukleotida diinkorporasikan ke dalam rantai DNA komplementer. Kamera beresolusi tinggi menangkap sinyal fluoresen yang dihasilkan, dan informasi ini digunakan untuk menentukan basa yang ditambahkan. Setelah pencatatan, terminator kimia dilepaskan sehingga siklus berikutnya dapat dimulai.

Platform dan Instrumen

Illumina menyediakan berbagai platform sequencer, seperti MiSeq, NextSeq, HiSeq, dan NovaSeq. Setiap platform memiliki spesifikasi berbeda terkait kapasitas, kecepatan, dan panjang baca. Misalnya, MiSeq cocok untuk proyek skala kecil hingga menengah, sedangkan NovaSeq dirancang untuk proyek skala besar seperti pengurutan seluruh genom (whole genome sequencing).

Kelebihan

Beberapa kelebihan Illumina sequencing antara lain:

1. Throughput tinggi yang memungkinkan pengurutan miliaran fragmen DNA dalam satu run.
2. Tingkat akurasi yang tinggi dengan error rate rendah.
3. Biaya per basa yang relatif rendah dibandingkan metode konvensional.
4. Fleksibilitas untuk berbagai aplikasi, termasuk RNA-Seq, ChIP-Seq, dan amplicon sequencing.

Keterbatasan

Meskipun unggul, Illumina sequencing memiliki beberapa keterbatasan:

1. Panjang baca relatif pendek dibandingkan teknologi seperti Oxford Nanopore Technologies atau Pacific Biosciences.
2. Membutuhkan peralatan dan infrastruktur laboratorium yang canggih.
3. Proses persiapan sampel dan analisis data yang kompleks.

Aplikasi dalam Penelitian

Teknologi ini digunakan dalam berbagai studi, antara lain:

1. Identifikasi varian genetik pada manusia.
2. Analisis transkriptom untuk memahami pola ekspresi gen.
3. Studi mikrobioma dalam kesehatan dan lingkungan.
4. Penelitian evolusi dan filogenetik.

Aplikasi Klinis

Dalam bidang klinis, Illumina sequencing dimanfaatkan untuk:

1. Diagnostik penyakit genetik melalui whole exome sequencing.
2. Deteksi dini kanker dengan analisis biopsi cair.
3. Pemantauan penyakit menular melalui pengurutan genom virus.

Analisis Data

Data hasil Illumina sequencing umumnya disimpan dalam format file FASTQ yang berisi urutan basa dan nilai kualitas. Analisis data melibatkan tahapan seperti trimming, alignment terhadap genom referensi, dan identifikasi varian. Perangkat lunak bioinformatika seperti BWA, Bowtie, dan GATK sering digunakan untuk memproses data ini.

Masa Depan dan Inovasi

Illumina terus mengembangkan inovasi untuk meningkatkan kecepatan, akurasi, dan keterjangkauan teknologinya. Penelitian diarahkan pada peningkatan panjang baca, pengurangan waktu analisis, dan integrasi dengan teknologi komputasi awan untuk pengolahan data besar. Dengan kemajuan ini, Illumina sequencing diperkirakan akan tetap menjadi tulang punggung penelitian genomik dan aplikasi medis di masa mendatang.